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IHC全攻略3:固定劑的選擇

時間:2018-10-11 14:59:49

IHC/ICC實驗中使用的所有樣本必須經過固定,以維持組織形態,并保留目的分子的抗原性。固定改變了組織的化學組成,因此往往需要在維持組織結構和保留表位之間進行折衷。細胞或組織的不完全固定(固定不足)可能造成組織內目的蛋白的快速水解,并降低了特異的免疫反應性。然而,過度的固定(固定過度)可能導致表位的遮蔽或強的非特異背景染色,這可能會掩蓋特異的標記。

理想的固定劑當然是:最好地保持細胞和組織的形態結構,并最大限度地保存抗原的免疫活性。然而,迄今為止尚無一種標準固定液能用于各種不同的抗原固定。經同一固定液固定后,不同組織可能呈現截然不同的染色結果。因此,不同的抗原和樣本必須反復試驗,選擇最佳的固定劑。

甲醛

甲醛是保留組織和細胞內蛋白靶點的最常用固定劑。甲醛介導的組織固定被認為依賴于蛋白-蛋白以及包含亞甲基橋(-CH2-)的蛋白-核酸交聯的形成。甲醛能化學連接NH2(氨基)和CONH(肽段)基團,NH2和NH,或NH2和NH2基團。

甲醛是大多數IHC/ICC應用的良好選擇,但并不是一種通用的固定劑。甲醛的固定過度會修飾氨基酸(屬于表位中的一部分),并阻斷抗體與之結合。然而,在大部分情況下,利用抗原修復技術可暴露表位,以還原抗體結合。研究還表明甲醛會誘導磷酸化依賴表位的細胞內轉位,從細胞膜轉移至細胞質。在這種情況下,冰預冷的無水甲醇或無水乙醇是適當的替代。

注意:甲醛溶液應當分裝并凍存,或儲存在4-8?C不超過一個月。

醇類

最常用于細胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。甲醇和乙醇的分子結構與水相似。因此,它們與水競爭蛋白氫鍵,取代組織中的水分子。這通過降低蛋白的介電常數,使蛋白在等電點沉淀,并由于構象的改變,阻斷抗體-表位的結合。盡管醇類通過打斷氫鍵而影響蛋白的三級結構,但它們似乎能穩定蛋白的二級結構。

不過,通常認為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態。醇類不像甲醛那樣滲透,主要用于固定冰凍組織切片和細胞。因此,醇類固定更適合膜表面抗原。在醇類固定之后不推薦進行抗原修復,因為它通常認為太過劇烈,有可能損害組織切片或細胞的完整性。

丙酮

丙酮是一種強的脫水劑,能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

組織的固定

在研究小動物如小鼠、大鼠和豚鼠的完整組織時,整個動物的灌注固定是保留抗原的最佳方法。它包括用固定液來取代動物的全身血液。然而,整個動物的灌注還不足以固定目的組織。在這些情況下,解剖的組織可浸潤在固定劑中。例如,4%甲醛是組織灌注和浸潤固定的常用溶液。

為了在浸潤固定過程中加強固定劑的滲透,建議組織厚度不超過10 mm。對于完整的固定,固定劑的體積應當是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進行4-24小時。由于固定不足或固定過度可能降低或破壞組織的免疫反應性,因此優化固定條件很重要。

培養細胞的固定

與組織樣本不同,培養細胞的固定時間更短,且固定液的濃度更低。例如,用2%甲醛溶液在室溫下固定20分鐘,常常足以保留細胞形態和抗原性。

培養細胞的固定通常只是去除培養基,并加入固定液即可。不過,去除培養基后表面張力的變化可能損害某些細胞類型。如果是這種情況,固定劑可直接加入培養基中。例如,加入與培養基相同體積的4%甲醛,將得到2%甲醛溶液,它足以預固定細胞。在2分鐘后,預固定培養基應當替換成新鮮量的2%固定劑。預固定步驟讓細胞更加堅硬,這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。

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